根據實驗要求制備樣品完畢后。即可進行觀察。基本步驟如下：
(1)開啟儀器電源及光源：一般先開啟顯微鏡和激光器，再啟動計算機，然后啟動操作軟件，設置熒光樣品的激發光波長，選擇相應的濾光鏡組塊。以便光電倍增管(photomultipliertube，PMT)檢測器能得到足夠的信號結果。使用汞燈的注意事項同普通熒光顯微鏡。
(2)設置相應的掃描方式：在目視模式下.調整所用物鏡放大倍數，在熒光顯微鏡下找到需要檢測的細胞。切換到掃描模式，調整雙孔針和激光強度參數，即可得到清晰的共聚焦圖像。
(3)獲取圖像：選擇合適的圖像分辨率，將樣品完整掃描后，保存圖像結果即可。
(4)關閉儀器：儀器測定樣品結束后，先關閉激光器部分，計算機仍可繼續進行圖像和數據處理。若要退出整個激光掃描共聚焦顯微鏡系統.則應該在激光器關閉后，待其冷卻至少10分鐘后再關閉計算機及總開關。
聚焦離子束顯微鏡的操作注意事項及維護保養：
(1)儀器周圍要遠離電磁輻射源；
(2)環境無震動，無強烈的空氣擾動；
(3)室內具有遮光系統，保證熒光樣品不會被外源光漂白；
(4)環境清潔；
(5)控制工作溫度在5～25℃。
